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与Piwi蛋白相作用的RNA称为piRNA。piRNAs在基因组中显示出与众不同的定位类型。

与Piwi蛋白相作用的RNA称为piRNAs。piRNAs在基因组中显示出与众不同的定位类型,主要成群地分为长20–90kb的基因簇,其中的长片断的小分子RNA只能来源于单链。相似的piRNAs在人类和小鼠中均有发现,大部分基因簇出现在同一染色体的位置上。虽然piRNA的功能仍然需要研究阐明,但是生殖细胞中的piRNA富集现象和Miwi突变导致的男性不育表明piRNA在配子形成的过程中起作用。

piRNAPiwi-interactingRNA)是从哺乳动物生殖细胞中分离得到的一类长度约为30nt的小RNA,并且这种小RNA与PIWI蛋白家族成员相结合才能发挥它的调控作用。目前,越来越多的文献表明piRNA在生殖细胞的生长发育中的调控是由于Piwi-piRNA复合物引起的基因沉默导致的,但由于对piRNA的研究尚处于初级阶段,它的一些具体的功能和生源论尚在研究当中。综述了piRNA的最新研究进展。

生物体中RNA可以分成两大类:编码RNA和非编码RNA。非编码RNA中有许多种小RNA,在高等生物体内存在着大量的非编码小RNA,它们组成了细胞中高度复杂的RNA调控网络,在调节时序发育、细胞增殖、不对称发育、树突状脊的发育、胚胎早期发育、肿瘤的发生发展、干细胞分化及抗病毒等整个细胞水平的几乎所有事件中起着重要的调控作用。

在非编码小RNA的研究中,小干扰RNA(siRNA)和微小RNA(microRNA,miRNA)的研究起步较早、研究也较深入。siRNA是一类约21~25nt的RNA分子,由Dicer(RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成,通过完全互补配对的方式与目标mRNA结合,引起其降解,从而导致靶基因的的沉默。miRNA是一种长度为21~25nt的单链小分子RNA。它广泛存在于真核生物中,成熟的miRNA,5′端有一个磷酸基团,3′端为羟基,它是由70~90个碱基、具发夹结构单链RNA前体(pre miRNA)经过Dicer酶加工而成,主要通过与靶标基因不完全互补结合,进而抑制翻译或促进mRNA聚腺苷酸尾巴(polyAtail)的去除等方式调控靶基因的表达 [1]。但最近的相关研究发现,生物体内还存在与前两种小RNA长度不同的另一类非编码小RNA,它们的长度约为30nt,通过与Argonaute家族蛋白等结合来调控mRNA的稳定性、蛋白质的合成、染色质组织和基因组的结构。

2006年7月,Nature和Science等杂志几乎同时报道了一类新的非编码小RNA,发现它们与生殖细胞发育密切相关[2,3]。最初,Aravin等 [2]发现了该种小RNA,他们在3个月大的C57BL/6J雄性小鼠中利用离心淘析技术从输精小管中获得了生殖细胞。从小鼠全睾丸组织的全细胞裂解液中进行了MILI核糖核蛋白复合体的免疫共沉淀分离了核酸,并利用亲和方法纯化了抗MILI-pepN2的抗体收集了一段多肽。从小鼠和人的睾丸总RNA中分离出的小RNA进行凝胶纯化,克隆和测序。结果发现有两种不同大小的小RNA:26~28nt30nt左右的RNA。为了鉴定不同的RNA类群,他们克隆和测定了从睾丸中获得的MILI interactingRNA和RNA,长度范围在18~26nt和24~33nt之间。序列分析表明85%为MILIinteractingRNA,88%的是含有5′U嘧啶的24~33nt的RNA。基因组的聚类分析对应了1500多条MILIinteractingRNA的序列,根据在最大距离为15kb的两个连续位点之间,表明有80%的克隆只来源于42个基因区,我们还发现,76%的这些序列确立了22~23nt的库,也对应于相同的区域,这些区域也似乎同时产生了原本存在于睾丸总RNA中的26~28nt的MILIinteractingRNA和富含29~31nt的RNA。他们根据Piwi蛋白家族的成员MILI与这些小RNA的相互作用,命名为PiwiinteractingRNAs,即piRNAs。紧接着,Girard等 [3]在睾丸总RNA分离过程中也检测到了这种小RNA,它与MIWI蛋白(一种鼠科的Piwi蛋白)结合。他们用小鼠17号染色体,大鼠20号染色体和人的6号染色体进行分析,发有类似的piRNA,大多数基因簇出现在同线位置上。此外,相继有3篇文章也分别报道了在小鼠的生精细胞、生殖系细胞以及睾丸中发现了piRNA,其中日本的实验室根据来源将其命名为germlinesmall RNA(gsRNA),由于命名原则的不同,故在名称上存在一定的差异 [4~6]。

在果蝇中已经鉴定了5种Argonaute蛋白:Ago1,Ago2,Ago3,Piwi和Aubergine(Aub),其中Ago1和Ago2属于Ago亚家族,是普遍表达的,而Ago3,Piwi和Aub属于Piwi亚家族,它的表达具有种系特异性 [7],Ago3,Piwi和Aub与非编码小RNA的另一个成员———重复相关小RNA(repeatassociatedsmallinterferingRNAs,rasiRNAs)也存在相互作用关系 [8]。rasiRNA最初发现于果蝇和斑马鱼的胚胎发育时期 [9,10],最近又发现在果蝇的生殖系细胞中也存在 [11,12],表达rasiRNA高度富集在睾丸和早期胚胎中。rasiRNA长度为22~24nt,与转座因子、卫星和微卫星DNA以及Stellate重复抑制基因类似,它可能来源于长片段dsRNA的反义链,需要Dicer3(RNaseШ)催化,但没有2′,3′末端羟基的特性。rasiRNA也与Piwi蛋白相结合可能在生殖细胞中沉默逆转录转座子和重复元件来调节着果蝇的生殖系的发育,它的沉默机制可能与piRNA的调节方式存在一定的关系。

piRNA是一类长度为24~31nt单链的小RNA,大部分集中在29~30nt,与miRNA和rasiRNAs一样,5′端也具有强烈的尿嘧啶倾向性(约86%)。虽然rasiRNA和piRNA的大小相似,但有两点不同:首先,piRNA以高度特异链的方式对应于基因组,相反,rasiRNA在有义或反义定位之内对应于重复区域,它们似乎是由长dsRNA前体随机产生的。其次,piRNA主要对应于单链基因组位点,但是rasiRNA是通过定义可转座元件在内的重复位点来对应的。piRNA的表达具有组织特异性,调控着生殖细胞和干细胞的生长发育,目前只在老鼠[2~6]、果蝇 [13]、斑马鱼 [14]等哺乳动物的生殖细胞中发现了这类小分子。

piRNA在染色体上的分布极不均匀,在小鼠中它们主要分布于17、5、4、2号染色体上,而很少分布于1、3、16、19和X染色体上,基本不分布于Y染色体上[4]。另外,piRNA主要存在于基因间隔区,而很少存在于基因区或重复序列区。它们主要成簇分布在1~100kb相对较短的基因组位点,且包含有10~4500个小分子RNA [15]。由于piRNA成簇分布,且每一个几乎都具有同一取向,说明同一簇piRNA可能来源于同一长初始转录物,但有一部分成簇的piRNA会突然改变取向,说明这些双向的成簇piRNA可能由相同的启动子按不同的方式转录而来[15]。

研究表明,piRNA主要存在于哺乳动物的生殖细胞和干细胞中,通过与Piwi亚家族蛋白结合形成piRNA复合物(piRC)来调控基因沉默途径。对Piwi亚家族蛋白的遗传分析以及piRNA积累的时间特性研究发现,piRC在配子发生过程中起着十分重要的作用。经过研究人员分析发现,只有17% ~20%的哺乳动物piRNA对应于标记的重复序列,包括转座子和逆转录转座子[15]。因此,piRNA从后生程序化和抑制转录到转录后调控可能会有不同的功能。根据Piwi蛋白已知的功能推测piRNA的功能可能有3个方面 [16,17]。

3.1 沉默转录基因过程

在果蝇中的研究已经表明Piwi和rasiRNA的作用是沉默重复元件。在裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)中,小RNA和RNAi途径涉及到了转录基因沉默(TGS)。在研究哺乳动物中TGS的因子时,纯化得到了一个包含小RNA和Riwi的复合物(与人类Piwi同源),该复合物称为piRNA复合物。它的制备物中包含rRecQ1,与脉孢菌(Neurospora)qde-3基因的表达蛋白同源,而该基因参与沉默途径。因此推断,哺乳动物的piRNA可能在TGS中起作用[6]。

在果蝇中,一个asyetuncloned异染色质基因的功能性等位基因flamenco能抑制内源性逆转录酶病毒gypsy。Piwi突变体,是已经知道的影响RNA介导的同源决定的转基因沉默,也说明了在限制性的雌性生殖腺中阻断gypsy的抑制作用。因此,推断piRNA的功能和Piwi蛋白密切相关,具有Piwi依赖性 [18]。又发现,在flamenco敲除突变体中成熟piRNA的表达水平大量地减少[13],而在Piwi敲除突变体中gypsyRNA的表达水平却增加了150倍[18],这些结果说明Piwi蛋白结合的piRNA的功能是维持转座子沉默。

在另一项研究中发现了果蝇中存在的一种AubassociatepiRNA的沉默机制 [19]。Aub突变体导致了卵巢和睾丸中的逆转录转座子的积累,以及睾丸中的Stellate转录物的积累。在卵巢中AubassociatepiRNA来源于包括逆转录转座子在内的基因间的重复元件。而在睾丸中的Aub也联合着不同的piRNA。大多数piRNA与Stellate抑制基因转录本的反义链对应,Stellate是已知的关于基因沉默的基因,另一个富含的种类是由来自X染色体和与vasa转录本高度互补的序列组成。这是首次以生物化学的观点提出了由Aub和piRNA介导的沉默机制。

3.2 维持生殖系和干细胞功能

Piwi是一个表观遗传调控因子,起着调节生殖干细胞维持的作用 [20]。Polycombgroup(PcG)蛋白可以维持关键的发育调节因子。在果蝇中,PcG与PcG反应元件(PREs)结合沉默持家基因。在果蝇基因组中,Piwi与PcG蛋白体共定位簇集成PcG反应序列 [21]。这样,一些Piwi有关的piRNA可能与表观遗传调控有关。研究人员在果蝇中检测了关于RNA积聚而假定的RNA沉默机制的效果。这些积聚的RNA包括不同的gypsy序列并报道了沉默的效果确实是与存在于卵巢中25~30nt长度的有义RNA的数量有关。实验结果发现rasiRNA对gypsy转录本的有义链有下调作用 [22],而且,在雄性生殖系中,Piwi蛋白能够阻止逆转录转座子的转录 [23]。这样证据表明一些piRNA可能与后生调控有关。

Piwi亚家族主要有3个成员,分别是MIWI,MILI和MIWI2,是生殖系细胞中的特异性蛋白 [24,25],与精子的发生有非常密切的关系,敲除Miwi,Mili或Miwi2基因,都会造成小鼠精子产生明显缺陷,表现为雄性不育 [24~26]。MILI在早期的精子发生时表达,即从精原细胞的有丝分裂到精母细胞的粗线期,缺失MILI的小鼠则停止在粗线期;MIWI的表达则要晚一些,从粗线期到球形精细胞期,基因敲除的MIWI会导致精子发生停止在球形精细胞期。而基因敲除的MIWI2的小鼠在减数分裂早期有减数分裂进展的缺陷,并且生殖细胞随着龄期有显着的损失[25]。MIWI2突变体中生殖细胞表型的损失,和果蝇中Piwi突变体一样,证明了小鼠中的MIWI2和果蝇中的Piwi在维持生殖系和干细胞时起着类似的作用。

尽管piRNA的具体功能还未完全弄清,但是生殖细胞中的piRNA富集现象和Miwi突变种的雄性不育表明了piRNA在配子发育的过程中起重要作用,并且可能参与配子发生过程中基因表达模式及染色体组结构的调节。

3.3 调节翻译和mRNA的稳定性

Wilson等 [27]在果蝇胚胎发育时发现aub在osker翻译时有很重要的作用。尽管aub突变体似乎没影响oskermRNA或Osker蛋白的稳定性,但在这突变体中Osker蛋白表达量却明显地减少了。Megosh等 [28]对果蝇中的Piwi蛋白研究发现,Piwi的减少不能影响Osk和Vasa蛋白的表达但能导致极质维持和原始生殖细胞(PGS)形成的失败,而增加Piwi蛋白的表达量能提高Osk和Vasa蛋白的水平,也相应成比例地提高PGS的数量。由此推断,Piwi和Aub在果蝇胚胎发育时的翻译可能具有正调节作用。同样Miwi也可能促进睾丸中精子形成时一种主要调节子(CREM)的稳定性和目标mRNA翻译的稳定性 [26,29]。

piRNA发现后,这类小RNA的来源一直是研究人员的研究重点之一。piRNA簇的链的强偏向性说明了它们可能产生于单链的前体,为了支持这个观点,EST分析和RT、PCR实验都显示了假定的初始转录本,但是在反义转录本中却未检测到[5]。与miRNA前体不同,覆盖有piRNA克隆的区域没有折叠入茎环结构。因此,piRNA的生物发生途径明显不同于miRNA和siRNA。尽管之前的研究表明人类的Piwi蛋白能够与Dicer酶相互作用 [30],但并没有确定piRNA生物发生过程中是否与RNAaseIII如Dicer和Drosha有关。为检测Dicer酶的必备条件,研究人员将携带有纯合子dicer突变体的生殖细胞放在dicer野生型细胞的周围。然后,从这些动物精巢中分离纯化发现了标准水平的piRNA,这强有力地说明了piRNA的生物发生是与Dicer无关的[14]。

研究人员提出了几种可能的piRNA生源论机制[2,5]:(1)长距离dsRNA结构可能形成了前转录物,它能够解释piRNA链的偏向性;(2)反义转录物可能以很低的水平表达来避免检测;(3)前转录物可能由ssRNA-directed未识别的酶消化;(4)piRNA可能来源于由逆转录转座子的逆转录酶产生的RNA-DNA双链体。

在果蝇和斑马鱼的研究中提出了Piwi蛋白作用的piRNA 的生源论机制[12~14]。Gunawardane等[12]在果蝇卵巢中免疫纯化了Aub和Ago3,并且分析了结合有不同Piwi蛋白的小RNA的序列。发现Piwi关联的RNA与果蝇基因组中缺失的转座子元件相对应。他们预测了与siRNA或miRNA相似的加工机制,首先在piRNA的两条链的3′端由RNaseIII产生的2nt的悬突,即piRNA的两条链在5′端的23nt处切割(假定piRNA的平均长度为25nt)。他们绘出了piRNA5′端和5′近邻端的反义链的距离,根据预测的23nt的峰值处,发现piRNA5′端的互补链经常是在10nt处切割的,还发现piRNA在Ago3和Aub复合体中有很强的互补关系。在piRNA两条链中的10nt的重叠促使了Piwi蛋白在piRNA的生物发生中起作用的假说。因此,提出了一个ping?pong模型(图1) [12,31]:一个反义piRNA,衍生于络合有Aub或Piwi的piRNA基因座,能识别和分离有义链的转座子转录物。这个分离事件发生在反义piRNA相对的10~11nt的位置,从原初piRNA末端的相反链上,产生了一个距5′端长度为10nt的片段。分离的产物将装载入第二种Piwi蛋白家族,根据观测链的偏向性很可能是Ago3,与Ago3相关的piRNA在位置10处有很高的腺嘌呤百分比例。最终,经3′端未知的机制加工后成为新的piRNA。

图1平pongmodelofpiRNAbiogenesis 小稿的piRNAs产生转座子监管区域的heterochromatin.These piRNA既Piwi和Aubareantisense sassociated,转座子转录和补充,它可以触发放大loop.Piwi /奥布劈开明欣获得转座子比录tween10和11新台比反义piRNA 5'端,随后产生piRNA.Ago3职能另一个切片机,它可以识别piRNA clustertranscripts Ago3相关的意识,然后产生更多的Piwi / Aubassociated一tisense链piRNAHouwing等[14]在研究斑马鱼中的piRNA时发现,piRNA簇集与所有的GypsyDR1和GypsyDR2的位点有义链匹配,也是缺少U的偏向性。相反,如前面所述,在10nt位置富含A。这说明了进化的保守不仅是piRNA生物发生的策略,还是转座子调控的一种生物化学途径。

先前的文献表明哺乳动物的piRNA在3′端的2′O甲基化。piRNA的生物合成机制和修饰功能仍旧不清楚。Kirino等 [32]报道了植物miRNA2′O甲基转移酶HEN1在小鼠中的同源蛋白mHEN1,它在体外培养的睾丸中特异性表达并且使piRNA的3′端发生了甲基化,而HEN1在果蝇中的同源蛋白Pimet则介导了piRNA3′端的2′O甲基化作用 [33]。Iguchi等 [34]在研究小鼠中的两种蛋白(MSY2和Translin)时发现,包含有Nct1和Nct2的一段序列与piRNAs的序列相同,并检测到它们主要存在于精母细胞的粗线期。此外,还发现在精子发生进行时,单一拷贝的piRNAs,gsRNA10(其序列与在Nct1的29nt相同)的增加伴随着Nct1和Nct2的减少,因此提出了Nct1和Nct2是piRNA前体的一部分。这些结果对piRNA的生源论研究提供了很好的理论基础。

印度科学家SaiLakshmiS及其合作者建立了一个piRNA数据库———piRNABank,以保存新发现的piRNA序列。piRNABank是一个高度用户友好的资源,它收录了包括人、小鼠和大鼠的近2000万个piRNA相关序列,经过同源序列去除、基因组定位等筛选,最近得到10万多个在基因组中具有唯一靶位点的piRNA序列。数据库支持物种和染色体方式的多种的搜索方式,包括登录号、染色体定位、基因名或符号,基于同源性的序列检索,簇和相应基因及重复元件。它也可以在基因组大图谱上显示每个piRNA或piRNA簇。数据库内的信息也将随着新的研究进行不断更新,果蝇和其它物种的piRNA信息也将会被收录,作者还计划增加一些序列和结构预测的软件,更方便科研人员使用 [35]。

piRNA的发现为非编码小分子RNA的研究开辟了一个新领域,被Science评为2006年十大科技进展之一 [36]。到目前为止,piRNA的研究已经取得了阶段性的成果,但要预测piRNA在生物医学上的应用还为时过早。其中仍然有许多问题需要进一步研讨,如piRNA的序列在不同物种中的同源保守性还不好分析;在piRNA生源论中,仍旧不知道3′端的分裂机制和piRNA扩增循环是如何调节的。另一个尚未解决的问题是piRNA在特异位点表达的结果所产生的功能以及piRNA3′端甲基化的机制还没有弄清楚。piRNA和Piwi蛋白在后生调控中起的作用很可能大于转座子沉默的作用,实验室研究非生殖器官Piwi蛋白高表达组织中,piRNA的克隆及调控作用,但尚未取得有意义的进展。

因此,piRNA的研究不仅可以丰富小分子RNA的研究内容,同时,也有利于进一步了解生物配子发生的分子调控及其机理,具有十分重要的理论价值和应用前景 。


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